La ciencia de la vida : febrero 2016

viernes, 26 de febrero de 2016

domingo, 7 de febrero de 2016

EXTRACCIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS (PRÁCTICA DEL LABORATORIO)

EXTRACCIÓN DEL ADN Y ARN (ácidos nucleicos)

Para comenzar cogeremos dos trozos de hoja de tomate y los introduciremos en cada tubo, seguidamente, añadiremos 250 0 µl de tampón de extracción y lo trituraremos todo .

Después añadiremos 35 µl de SDS ,un detergente,e incubaremos los tubos a 65 ºC durante 5 minutos.
Una vez incubados, añadiremos 130 µl de acetato de potasio,un polvo blanco cristalino que se puede disolver en agua y algunos alcoholes, también se puede presentar en cristales incoloros e inodoros. 5 M y volveremos a incubar pero a temperatura ambiente, también durante 5 minutos.

Centrifugaremos los tubos a 13.000 rpm durante 10 minutos y pasaremos el sobrenadante, que es la fase líquida superior que aparece cuando uno centifuga una muestra, de modo que cuando uno lo saca de la centrífuga queda el sobrenadante arriba, (500 µl) a un tubo limpio, llevando mucho cuidado.

Más tarde añadiremos 500 µl de isopropanol, el cual se obtiene por fermentación de distintos tipos de sustancias naturales ,y 60 µl de acetato de sodio 3 M e incubaremos a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, los centrifugaremos a 13.000 rpm durante 10 minutos y eliminaremos la mayor cantidad posible del líquido sobrenadante.
Añadiremos 300 µl de etanol al 70 %.

Centrifugaremos los tubos a 13.000 rpm durante 5 minutos y eliminaremos la mayor cantidad posible de alcohol. Una vez que esté completamente seco añadiremos un poco de agua estéril (30 a 100 µl).
Para finalizar, lo conservaremos en la nevera a 4 ºC durante meses.

Para comprobar la calidad de la extracción se puede realizar una electroforesis, es decir, una técnica separativa que emplea un campo eléctrico aplicado que actúa sobre partículas cargadas causando su movimiento a través de una matriz.Junto con extracciones ya comprobadas.

PREPARACIÓN GEL DE AGAROSA

Para empezar,prepararemos los geles de agarosa, la agarosa es es un polisacárido formado por galactosas alfa y beta que se extrae de las algas,es un producto natural que forma una matriz inerte y no tóxica que supone una herramienta indispensable en gran cantidad de técnicas de biología molecular, bioquímica y biología celular. Su uso más extendido es para construir geles que permitan separar moléculas de ADN mediante electroforesis, además de ser utilizada para fijar moléculas a su estructura como anticuerpos, antígenos y enzimas. Igualmente se utiliza para el cultivo celular y microbiología. Otros usos menos extendidos son la utilización de estos geles como matrices en la reparación de tejidos dañados. La preparación consta de las siguientes etapas:

En primer lugar cogeremos el volumen necesario del tampón de electroforesis y lo verteremos en un matraz.
En segundo lugar pesaremos la agarosa y la depositaremos en el matraz, un recipiente de vidrio.
Disolveremos la agarosa en un microondas, hasta que comience el proceso de ebullición. Cuando la agarosa se haya disuelto completamente en el tampón, la dejaremos enfriar, mientras tanto, cerraremos el portageles con cinta adhesiva y colocaremos el peine sobre el portageles.

A continuación, añadiremos bromuro de etidio, es usado comúnmente como aclarador de ácidos nucleicos en laboratorios de biología molecular para procesos como la electroforesis en gel de agarosa, esta sustancia tiene un poderoso efecto mutágeno y, posiblemente puede ser cancerígeno ; a la disolución de agarosa, hasta una concentración final de 0,5 µg/ml y agitaremos la disolución y la verteremos en el portageles, donde polimerizará al enfriarse.

Una vez que la agarosa se haya solidificado retiraremos el peine y la cinta adhesiva.
El gel lo conservaremos a 4°C en el frigorífico, envolviéndolo con una lámina de plástico transparente, para evitar su deshidratación.